質量分析

ESI-MSが確認分子は合成が主張するものです。

陽性モードのエレクトロスプレーイオン化、観測された分子量が理論配列と±1 Da以内で一致。HPLCが置き換えられないアッセイ — そして切断とアダクトが隠れられないアッセイ。

COAのMSデータを見る完全なQCワークフロー

±1 DaMW許容範囲

ESI+イオン化モード

100%検証されたロット

エンドツーエンドワークフロー

サンプルアリコートから同一性確認までの6ステップ。

質量分析は確認アッセイです — HPLCが答えられない質問に答えます。クロマトグラフィー純度下限をクリアした同じロットがリリースに署名される前にこのパスを経由します。

01
分注と希釈

HPLCで分析した同一サンプル20 µgを、50:50アセトニトリル/水 + 0.1%ギ酸で5 µg/mLの作業濃度に希釈。ソースオーバーロードなしで安定したエレクトロスプレーを得るための最適濃度です。
≈ 0.2時間 · 5 µg/mL準備
02
キャリブレーション確認

ポリペプチド参照（ヨウ化セシウムクラスターイオンまたは配列決定された標準）に対してキャリブレートされた装置、フルスキャン範囲全体で< 5 ppmのm/z精度を確認。ドリフトした装置ではサンプルを実行しません。
事前実行 · < 5 ppmドリフト
03
直接注入（またはLC-MS）

サンプルをガラスシリンジに入れてESIソースを通じて5 µL/minで注入。複雑なサンプルには、インライン脱塩のためにMS互換移動相（ギ酸がTFAに代わる）でインラインHPLCカラムを使用。
≈ 0.3時間 · 5 µL/min注入
04
フルスキャン取得

陽性エレクトロスプレー、キャピラリー4.0 kV、ソース150 °C、コーン40 V。スキャン範囲m/z 100〜3000（1スペクトル/秒）、シグナル安定性と同位体エンベロープの明瞭さのため60秒平均。
≈ 1分 · スキャン平均化
05
チャージ状態デコンボリューション

マルチチャージピーク（9 kDaペプチドでは通常[M+4H]4+から[M+12H]12+）は最大エントロピーアルゴリズムによって単一の中性分子量にデコンボリューションされます。出力：同位体分解精度を持つ1つのMW値。
自動化・MaxEnt
06
同一性決定

配列から計算された理論MWと比較された観測MW。≤ ±1 Da偏差：同一性確認、ロットはLALエンドトキシン試験に進む。より大きな偏差：ロットは保留され合成バッチが調査される。
QCオフィサー · 署名済み

マススペクトルの構造

マルチチャージエンベロープを1つの数値にデコンボリューション。

エレクトロスプレーは同一分子のマルチプロトン化イオンのシリーズを生成します。エンベロープのパターン自体が確認です：クリーンで予測可能な分布は単一の定義された種を意味します。その読み方を以下に示します。

ESI-MS · IGF-1 LR3 · Lot LR3-2025-A47 · 陽性モードデコンボリューションMW · 9111.2 Da

50010001500200025003000 m/z

チャージエンベロープ

[M+12H]12+から[M+4H]4+までの8つのプロトン化状態が、きれいなガウスエンベロープに分布しています。形状自体が単一の定義された分子であることを確認します；キメラや汚染は歪みをもたらします。

デコンボリューションMW

最大エントロピーアルゴリズムはマルチチャージエンベロープを1つの中性質量に縮小します：9111.2 Da。理論値：9111.5 Da。Δ = −0.3 Da — ±1 Daリリースウィンドウ内。

ベースライン

チャージ状態間はフラット、寄生イオンなし、Na+/K+アダクトラダーなし、早期溶出マトリクス干渉なし。最も豊富なピークのシグナル対ノイズは200:1を超えます。

方法パラメーター

ソース、分析計、スキャン、キャリブレーション。

パラメーターが開示されていない質量分析はスタンプ付きの数値に過ぎません。ラボが実行するものを正確に以下に示します — 最新のQ-TOFまたはOrbitrapクラスの装置で再現可能。

イオン化源

モード	エレクトロスプレー、陽性（ESI+）
キャピラリー電圧	4.0 kV
コーン電圧	40 V
ソース温度	150 °C
デソルベーションガス	N₂, 800 L/h, 350 °C
流量	5 µL/min（直接注入）

質量分析計

タイプ	Q-TOF、高分解能
分解能	≥ 25 000 FWHM
質量精度	< 5 ppm RMS
スキャン範囲	m/z 100 – 3000
スキャンレート	1 spectrum/sec
取得	60秒、シグナル平均化

キャリブレーションとQC

キャリブラント	ギ酸ナトリウムクラスターイオン
頻度	日次ロックマス + バッチごと確認
ドリフト拒否	> 5 ppm = 測定不可
システム適合性	参照ペプチド、m/zと強度
複製	1ロットあたり2回の取得
参照標準	独立、ロットトレーサブル

サンプルと処理

希釈剤	50:50 ACN/H₂O + 0.1% formic acid
濃度	5 µg/mL作業溶液
処理されたチャージ状態	通常 +4〜+12
デコンボリューション	MaxEnt、ベイズモデル
出力質量許容範囲	± 0.1 Da resolved
報告	理論MWとの差、Da

質量精度ティア

MW偏差が実際に意味すること。

ペプチドは配列であり、配列には定義された質量があります。観測MWと理論MWの偏差はシグナルです — 時には無視でき、時には合成失敗を意味します。その読み方を説明します。

< 0.5 Da典型的なIGF1 Shopリリース

相当ppm（9 kDa）< 55 ppm

それが意味すること同一性確認済み

当社のロットのほとんどが実際に位置する場所。同位体エンベロープ精度内 — 分子が原子対原子で配列と一致。

0.5 – 1.0 Daリリース上限

相当ppm（9 kDa）55 – 110 ppm

それが意味すること許容範囲内、フラグなし

±1 Daリリースウィンドウ内。大きなペプチドでのキャリブレーションノイズの可能性；配列の完全性は無傷。

1 – 5 Da調査する

相当ppm（9 kDa）110 – 550 ppm

それが意味すること再取得、再キャリブレート

リリースウィンドウ外ですが一般的な修飾質量内。新たにキャリブレートされた装置で再実行；確認された場合、ロットは保留。

> 5 Da棄却

相当ppm（9 kDa）> 550 ppm

それが意味すること誤った分子

配列エラー、欠落残基、重大な修飾、または誤ったバイアルラベル。即座に棄却され合成バッチが調査される。

二次ピークを読む

スペクトルのすべての質量シフトが意味すること。

HPLCが保持時間シフトでストーリーを語るように、ESI-MSは質量シフトでストーリーを語ります。同じ二次ピークが合成全体に繰り返し現れます — そして各々が特定の失敗モードを指しています。

質量シフト修飾考えられる原因アクション

+ 16 Da メチオニン / Trp酸化精製中の空気曝露許容 < 0.5%

+ 1 Da Asn / Gln脱アミド化経時変化サンプル、塩基性条件 > 0.3%を調査

+ 22 Da ナトリウムアダクト [M+Na]+ 塩汚染、ガラス器具化粧品 < 1%

+ 38 Da カリウムアダクト [M+K]+ 塩汚染化粧品 < 1%

+ 114 Da TFAアダクト HPLCからの残留イオンペアリング試薬化粧品 < 0.5%

− 残基質量切断 / 欠失合成中のカップリング失敗 > 0.5%を棄却

＋残基質量挿入 / ダブルカップリング副反応、汚染された試薬 > 0.3%を棄却

≈ 2× MW ダイマー（共有または非共有）ジスルフィド結合、凝集 > 1%を棄却

ハード失敗

同一性を棄却する4つの条件。

HPLC純度99%以上はロットをMS棄却から救いません。これらはQCオフィサーがMS棄却に署名する条件です — クロマトグラフィー結果とは独立して。

デコンボリューションMW偏差 > ±1 Da

リリースウィンドウ。9111.5ではなく9113と読み取られる9 kDaペプチドは「十分近い」ではありません — 脱アミド化に一致する+1.5 Daシフトであり、ロットはシフトのソースが特定されるまで保留されます。

メインの1%を超える二次種

デコンボリューションスペクトルにおけるメインMWシグナルの1%以上の不純物ピークは、HPLCで分離できなかった修飾または切断を示します。HPLC純度に関わらず、ロットは調査されます。

チャージエンベロープの歪み

マルチチャージ分布がガウス分布でない場合 — 予想されるチャージ状態のギャップ、非対称テール、複数のエンベロープの重なり — サンプルには複数の種が含まれており、同一性は報告できません。

キャリブレーションドリフト > 5 ppm

すべてのバッチ前にギ酸ナトリウムラダーに対してキャリブレーションを確認します。スキャン範囲全体の質量精度が5 ppm RMSを超えた場合、装置を再キャリブレートするまでクライアントサンプルは取得しません。

2つのアッセイ、2つの質問

HPLCは「純粋ですか？」と尋ねます — MSは「正しい分子ですか？」と尋ねます

HPLCだけでペプチドをリリースすることは、見える単一ピークがラベルが主張する分子であることに賭けることです。質量分析はその質問に独立して答えます：同じサンプル、異なる物理学、異なる失敗モード。当社はすべてのCOAでそれらをペアにします — そしてロットが出荷される前に両方がクリアする必要があります。

よくある質問

研究者がMS検証について尋ねること。

MALDIではなくESIを使う理由は？

MALDI（マトリクス支援レーザー脱離/イオン化）はより高速でより汚れたサンプルに耐性がありますが、主に一価イオンを生成します — これにより使用可能な質量範囲が制限され、デコンボリューションがよりノイズが多くなります。ESIは〜30 kDaまでのペプチドで単一Da精度のMaxEntデコンボリューションをサポートするマルチチャージエンベロープを生成します。当社のカタログにはESIがより良いトレードオフです。

なぜppm精度ではなく±1 Daなのですか？

PPM精度は装置を記述します；±1 Daは*生物学的*閾値です。1 Daシフトは無傷のペプチドと脱アミド化アイソフォームを区別します — まさに同一性に重要なエラーの種類です。当社は内部でppmで質量精度を報告し（目標 < 5 ppm）、COAでは±1 Daに変換して数値が解釈可能な状態を保ちます。

同位体エンベロープとモノアイソトピック質量はどうですか？

5 kDa未満のペプチドにはモノアイソトピック質量（最低質量同位体）を報告します；同位体が未分解の5 kDa超のペプチドには自然存在比から計算した平均質量を報告します。COAは常にどちらの規則が使用されるかを明示し、理論値との比較が明確になります。

MSは配列を確認しますか、それとも分子量だけですか？

標準ESI-MSスキャンはMWのみを確認します。配列レベルの確認には、MS/MS（衝突誘起解離、ペプチドをb-・y-イオンに断片化して残基ラダーを読み取る）をオンデマンドで実行します — 機関購入者のリクエストに応じて含まれるか、リリースサンプルが調査を引き起こした場合に実施。

MSはグリカット、PEG化または脂質化を検出できますか？

はい — これらはすべて定義された質量シフト（ヘキソースあたり162 Da、PEGのエチレンオキサイドあたり44 Daなど）を生成し、シフトしたメインピークまたは二次種として現れます。当社はCOAの「観察」欄に既知の修飾と一致する予期しない質量シフトにフラグを立てます。

なぜ合成施設の社内MSを信頼しないのですか？

同じ理由で当社はHPLCを信頼しません：自社製品を承認するラボは自身の系統的エラーを捕捉できません。独立した契約ラボは異なる装置、異なるキャリブレーション履歴、異なるオペレーターを使用します — そしてその独立性がCOAの核心です。

ESI-MSが確認 分子は合成が主張するものです。