ESI-MS 确认 该分子与合成声明一致。
正模式电喷雾电离，实测分子量与理论序列匹配偏差在 ±1 Da 以内。这是 HPLC 无法替代的检测——也是截短体和加合物无法隐藏的检测。
从样品等分到身份确认的六个步骤。
质谱是一种确证性检测——它回答 HPLC 无法回答的问题。通过色谱纯度下限的同一批次在签署放行前经过此流程。
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01
分装与稀释
HPLC 所用同一样品取 20 µg，用 50:50 乙腈/水 + 0.1% 甲酸稀释至 5 µg/mL 工作浓度——此为稳定电喷雾且不使离子源过载的最佳浓度。
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02
校准检查
仪器针对多肽参考物质（碘化铯簇离子或序列标准品）进行校准，全扫描范围内 m/z 准确度经验证 < 5 ppm。不得在漂移仪器上运行样品。
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03
直接注射（或 LC-MS）
样品装入玻璃注射器，以 5 µL/min 通过 ESI 离子源注射。对于复杂样品，使用在线 HPLC 色谱柱在质谱兼容流动相（甲酸替代 TFA）中进行在线脱盐。
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04
全扫描采集
正模式电喷雾，毛细管 4.0 kV，离子源 150 °C，锥孔 40 V。扫描范围 m/z 100–3000，1 谱/秒，平均 60 秒以确保信号稳定性和同位素包络清晰度。
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05
电荷态去卷积
多电荷峰（9 kDa 多肽通常为 [M+4H]<sup>4+</sup> 至 [M+12H]<sup>12+</sup>）通过最大熵算法去卷积为单一中性分子量。输出：一个具有同位素分辨精度的分子量值。
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06
身份判定
实测分子量与从序列计算的理论分子量比较。偏差 ≤ ±1 Da：身份确认，批次进入 LAL 内毒素检测。更大偏差：批次保留，合成批次接受调查。
多电荷包络，去卷积为单一数值。
电喷雾产生同一分子的一系列多质子化离子。包络的模式本身即为确认：干净、可预测的分布意味着单一确定的物质。以下是解读的要点。
电荷包络
八种质子化态从 <b>[M+12H]<sup>12+</sup></b> 到 <b>[M+4H]<sup>4+</sup></b>，分布于干净的高斯包络中。包络形状本身即可确认单一确定的分子；嵌合体或污染物将导致其变形。
去卷积分子量
最大熵算法将多电荷包络还原为单一中性质量：<b>9111.2 Da</b>。理论值：9111.5 Da。Δ = <b>−0.3 Da</b>——完全在 ±1 Da 放行窗口内。
基线
电荷态之间平坦，无寄生离子，无 Na<sup>+</sup>/K<sup>+</sup> 加合物阶梯，无早洗脱基质干扰。最强峰的信噪比超过 200:1。
离子源、分析器、扫描、校准。
没有披露参数的质谱只是一个带印章的数字。以下是实验室运行的精确条件——可在任何现代 Q-TOF 或 Orbitrap 级仪器上重现。
电离源
| 模式 | 电喷雾，正模式（ESI+） |
|---|---|
| 毛细管电压 | 4.0 kV |
| 锥孔电压 | 40 V |
| 离子源温度 | 150 °C |
| 去溶剂气 | N₂, 800 L/h, 350 °C |
| 流速 | 5 µL/min（直接注射） |
质量分析器
| 类型 | Q-TOF，高分辨率 |
|---|---|
| 分辨率 | ≥ 25 000 FWHM |
| 质量准确度 | < 5 ppm RMS |
| 扫描范围 | m/z 100 – 3000 |
| 扫描速率 | 1 spectrum/sec |
| 采集 | 60 s，信号平均 |
校准与质量控制
| 校准品 | 甲酸钠簇离子 |
|---|---|
| 频次 | 每日锁定质量 + 每批次核验 |
| 漂移拒绝 | > 5 ppm = 不允许进样 |
| 系统适用性 | 参考多肽，m/z 和强度 |
| 重复 | 每批次采集 2 次 |
| 参考标准品 | 独立，批次可溯源 |
样品与处理
| 稀释剂 | 50:50 ACN/H₂O + 0.1% formic acid |
|---|---|
| 浓度 | 5 µg/mL 工作液 |
| 已处理电荷态 | +4 至 +12（典型范围） |
| 去卷积 | MaxEnt，贝叶斯模型 |
| 输出质量容差 | ± 0.1 Da resolved |
| 报告 | Δ 相对理论分子量，单位 Da |
分子量偏差实际上意味着什么。
多肽就是其序列；序列具有确定的质量。实测分子量与理论分子量之间的偏差是一个信号——有时可忽略不计，有时则意味着合成失败。以下是我们解读这一偏差的方式。
我们批次实际落点所在范围。在同位素包络精度内——分子与序列逐原子匹配。
在 ±1 Da 放行窗口内。可能是大分子多肽的校准噪声；序列完整性完好。
在放行窗口之外，但在常见修饰质量范围内。在新校准的仪器上重新运行；如确认，批次保留。
序列错误、缺失残基、重大修饰或标签错误。立即拒绝并调查合成批次。
谱图中每个质量位移意味着什么。
就像 HPLC 通过保留时间位移讲述故事一样，ESI-MS 通过质量位移讲述故事。相同的次级峰在多次合成中重复出现——每个都指向特定的失败模式。
四种拒绝身份鉴别的情况。
HPLC 纯度超过 99% 并不能使批次免于质谱拒绝。以下是质控人员签署质谱拒绝通知的情况——与色谱结果无关。
去卷积分子量偏差 > ±1 Da
放行窗口。读数为 9113 而非 9111.5 的 9 kDa 多肽并非"足够接近"——这是与脱酰胺一致的 +1.5 Da 位移，批次保留直至确定位移来源。
次级物质 > 主峰的 1%
去卷积谱图中 ≥ 1% 主分子量信号的杂质峰表明存在 HPLC 无法分离的修饰或截短体。无论 HPLC 纯度如何，该批次均需进行调查。
电荷包络失真
如多电荷分布非高斯分布——预期电荷态出现空缺、不对称拖尾、多个包络重叠——则样品含有多种物质，无法报告身份鉴别结果。
校准漂移 > 5 ppm
每批次前以甲酸钠梯级离子验证校准。若扫描范围内质量准确度的均方根超过 5 ppm，则在重新校准仪器之前不得采集客户样品。