ESI-MS подтверждает молекула соответствует заявленному синтезом.
Электрораспыление в положительном режиме, наблюдаемая молекулярная масса сопоставляется с теоретической последовательностью с точностью ±1 Da. Анализ, который HPLC не может заменить, — и тот, от которого не скрыть ни укорочения, ни аддукты.
Шесть этапов от аликвоты образца до подтверждения подлинности.
Масс-спектрометрия — подтверждающий анализ; она отвечает на вопрос, на который HPLC не способна. Та же партия, прошедшая порог хроматографической чистоты, проходит этот путь до подписания выпуска.
-
01
Аликвотирование и разведение
20 µг той же пробы, проанализированной методом HPLC, разбавляли в смеси 50:50 ацетонитрил/вода + 0,1% муравьиная кислота до рабочей концентрации 5 µг/мл — оптимальный диапазон для стабильного электрораспыления без перегрузки источника.
-
02
Проверка калибровки
Прибор откалиброван относительно полипептидного референса (кластерные ионы иодида цезия или секвенированный стандарт), точность m/z проверена на уровне < 5 ppm по всему диапазону сканирования. Ни один образец не анализируется на приборе с дрейфом.
-
03
Прямое введение (или LC-MS)
Образец загружается в стеклянный шприц и вводится со скоростью 5 µL/мин через источник ESI. Для сложных образцов используется встроенная колонка HPLC в MS-совместимой подвижной фазе (муравьиная кислота заменяет TFA) для встроенного обессоливания.
-
04
Полноспектральное сканирование
Положительный электрораспыл, капилляр 4.0 кВ, источник 150 °C, конус 40 В. Диапазон сканирования m/z 100–3000 со скоростью 1 спектр/сек, усреднение за 60 секунд для стабильности сигнала и чёткости изотопной огибающей.
-
05
Деконволюция зарядовых состояний
Многозарядные пики (как правило, [M+4H]<sup>4+</sup> до [M+12H]<sup>12+</sup> для пептида 9 кДа) деконволюируются до единственной нейтральной молекулярной массы алгоритмом максимальной энтропии. Результат: одно значение МВ с изотопно-разрешённой точностью.
-
06
Решение об идентичности
Наблюдаемая МВ сравнивается с теоретической МВ, рассчитанной из последовательности. Отклонение ≤ ±1 Da: подлинность подтверждена, серия переходит на испытание эндотоксина LAL. Большее отклонение: серия задерживается, а синтетическая партия исследуется.
Многозарядный конверт, деконволюированный до одного числа.
Электрораспыление генерирует серию многократно протонированных ионов одной и той же молекулы. Паттерн огибающей сам по себе является подтверждением: чистое предсказуемое распределение означает единственный определённый вид. Вот как его интерпретировать.
Зарядовый конверт
Восемь состояний протонирования от <b>[M+12H]<sup>12+</sup></b> до <b>[M+4H]<sup>4+</sup></b>, распределённых в чистой гауссовой огибающей. Форма сама по себе подтверждает единственную определённую молекулу; химера или загрязнение искажали бы её.
Деконволюированная молярная масса
Алгоритм максимальной энтропии сводит многозарядную огибающую к одной нейтральной массе: <b>9111.2 Da</b>. Теоретическое значение: 9111.5 Da. Δ = <b>−0.3 Da</b> — значительно в пределах допустимого окна выпуска ±1 Da.
Базовая линия
Плоский между зарядовыми состояниями, без паразитных ионов, без аддуктных лестниц Na<sup>+</sup>/K<sup>+</sup>, без ранне элюируемых матричных помех. Отношение сигнал/шум наиболее интенсивного пика превышает 200:1.
Источник, анализатор, сканирование, калибровка.
Масс-спектрометрия без раскрытых параметров — это просто цифра с печатью. Ниже приведены именно те условия, которые использует лаборатория, — воспроизводимые на любом современном приборе класса Q-TOF или Orbitrap.
Источник ионизации
| Режим | Электрораспыление, положительный режим (ESI+) |
|---|---|
| Напряжение на капилляре | 4.0 kV |
| Напряжение конуса | 40 V |
| Температура источника | 150 °C |
| Газ десольватации | N₂, 800 L/h, 350 °C |
| Скорость потока | 5 µл/мин (прямое введение) |
Масс-анализатор
| Тип | Q-TOF, высокое разрешение |
|---|---|
| Разрешение | ≥ 25 000 FWHM |
| Точность измерения массы | < 5 ppm RMS |
| Диапазон сканирования | m/z 100 – 3000 |
| Скорость сканирования | 1 spectrum/sec |
| Регистрация | 60 с, усреднение сигнала |
Калибровка и контроль качества
| Калибрант | Кластерные ионы формиата натрия |
|---|---|
| Периодичность | Ежедневная lock-mass + проверка на каждую серию |
| Отклонение дрейфа | > 5 ppm = запуск запрещён |
| Пригодность системы | Референсный пептид, m/z и интенсивность |
| Повторности | 2 измерения на партию |
| Референсный стандарт | Независимый, с прослеживаемостью до партии |
Образец и обработка
| Растворитель / разбавитель | 50:50 ACN/H₂O + 0.1% formic acid |
|---|---|
| Концентрация | Рабочий раствор 5 µг/мл |
| Обработанные зарядовые состояния | +4 до +12 типично |
| Деконволюция | MaxEnt, байесовская модель |
| Допуск выходной массы | ± 0.1 Da resolved |
| Отчётность | Δ относительно теоретической молекулярной массы, в Da |
Что в действительности означает отклонение молекулярной массы.
Пептид — это его последовательность; последовательность имеет определённую массу. Отклонение между наблюдаемой и теоретической молярной массой — это сигнал, иногда незначительный, иногда свидетельствующий об ошибке синтеза. Ниже описано, как мы его интерпретируем.
Показатель, соответствующий большинству наших партий. В пределах точности изотопного конверта — молекула соответствует последовательности атом за атомом.
В пределах окна выпуска ±1 Da. Вероятно, калибровочный шум на крупном пептиде; целостность последовательности сохранена.
За пределами окна выпуска, но в пределах масс распространённых модификаций. Повторный прогон на свежекалиброванном приборе; при подтверждении серия задерживается.
Ошибка последовательности, отсутствующий остаток, грубая модификация или неверная маркировка флакона. Немедленный отказ — синтезная партия направляется на расследование.
Что означает каждый сдвиг массы в спектре.
Подобно тому, как HPLC рассказывает историю через сдвиги времён удерживания, ESI-MS — через сдвиги масс. Одни и те же вторичные пики повторяются от синтеза к синтезу — и каждый указывает на конкретный вид отказа.
Четыре условия, при которых идентификация отклоняется.
Чистота по HPLC выше 99% не спасает партию от отклонения по масс-спектрометрии. Это условия, при которых сотрудник по контролю качества подписывает отклонение по MS — независимо от хроматографического результата.
Отклонение деконволюированной молярной массы > ±1 Da
Окно выпуска. Показание 9113 вместо 9111.5 для пептида 9 кДа — это не «достаточно близко»: это сдвиг +1.5 Da, соответствующий дезамидированию, и партия задерживается до выявления источника сдвига.
Вторичные компоненты > 1% от основного
Пик примеси в деконволюированном спектре на уровне ≥ 1% от основного сигнала молярной массы свидетельствует о модификации или усечении, которые HPLC не смог разделить. Партия расследуется независимо от чистоты по HPLC.
Искажение зарядового конверта
Если многозарядное распределение не является гауссовым — пробелы в ожидаемых зарядовых состояниях, асимметричный хвост, перекрывание нескольких огибающих — образец содержит более одного вида и идентичность не может быть установлена.
Дрейф калибровки > 5 ppm
Калибровка проверяется по форматному лестничному стандарту натрия перед каждой серией. Если точность по массе по всему диапазону сканирования превышает 5 ppm СКО, пробы клиентов не регистрируются до повторной калибровки прибора.